Selection, Characterization and Application of Artificial DNA Aptamer Containing Appended Bases with Sub-nanomolar Affinity for a Salivary Biomarker. 2017 Jul 11;12(7):e0181186.Shiratori I, Akitomi J, Boltz DA, Horii K, Furuichi M, Waga I. Biochem Biophys Res Commun.
ã§ã³ã¤ããã¼ã¿Minagawa H, Onodera K, Fujita H, Sakamoto T, Akitomi J, Kaneko N, Shiratori I, Kuwahara M, Horii K, Waga I.
アプタマーをデリバリー剤として利用することも 考えられている．たとえば，ある膜蛋白質に対して 高い特異性を有するアプタマーに抗がん剤を結合し
本成果を基盤技術として、架橋型核酸である2',4'-BNAを高密度に挿入した人工核酸アプタマーや2',4'-BNAよりも分解耐性の高い架橋型核酸を挿入した人工核酸アプタマー、糖部位だけでなく塩基部位やリン酸部位を化学修飾した人工核酸アプタマーの作製法の確立を目指します。これにより、糖尿病や癌、加齢黄斑変性症などさまざまな疾患の原因物質に対してより強く結合し、かつヌクレアーゼ耐性に優れた人工核酸アプタマーの創製が可能となり、新たなバイオマーカー検出薬や分子標的薬の創製が期待されます。(注) 核酸アプタマー ： 抗体のように標的に対して特異的な結合活性を示す核酸分子。DNAからなるものをDNAアプタマー、RNAからなるものをRNAアプタマーという。化学修飾を導入したDNAやRNAからなるものは、人工核酸アプタマーとよばれ、医薬・診断薬の候補物質となっている。NEDOの若手研究グラント（産業技術研究助成事業）の一環として、群馬大学と大阪大学の共同研究グループは、癌や糖尿病といった疾患の原因物質に結合し、その働きを阻害する治療薬として期待される”架橋型核酸を含む人工核酸アプタマーの作製法”を世界で初めて確立しました。アフィニティー・ゲルを用いる古典的なSELEX法をはじめ、これまでに開発された多くの改良法では、固相に固定化された標的と液相中の核酸ライブラリーとの間の結合親和性の違いによって活性配列を分離します。しかし、これらの方法では、少量ながら核酸ライブラリーが固相に非特異吸着することは避けられません。そこで、工程〔1〕で固相を用いないキャピラリー・ゾーン電気泳動法に着眼し、これを人工核酸アプタマーのSELEXに応用することを試みました(図3)。キャピラリー・ゾーン電気泳動法では、標的もライブラリーも液相中に存在し、標的と活性配列との複合体と、標的に結合しない不活性配列とを高度に分離することができます。さらに、複合体は標的に結合していない核酸よりも先に泳動されるため、原理上、キャピラリーに吸着したものは複合体の分画に含まれることはありません。そのため、天然型のDNAライブラリーを用いた場合、従来のSELEX法に比べて5分の1から10分の1の少ないラウンド数で活性配列の分離を完了することができます。ラウンド数とは分離の工程とそれに続く増幅・複製の工程を1回と数えるもので、SELEXではこの一連の工程を複数回繰り返すことで濃縮させて活性配列だけを完全に分離します(図2)。SELEX法による核酸アプタマーの作製で重要な工程は、主に、〔1〕標的に対して特異的に結合する活性配列と標的に結合しない不活性配列の分離および〔2〕ポリメラーゼ反応による活性配列の増幅・複製の2つです。人工核酸ライブラリーでSELEXを行う場合、しばしば問題視されるのは前述したように工程〔2〕ですが、工程〔1〕の改良も重要と考えました。というのは、ポリメラーゼ反応の効率が低い場合、工程〔1〕で分離した活性配列にごく微量しか不活性配列が混入してなくても、工程〔2〕でそれが増幅され易ければ、結果的に不活性配列が優位に濃縮され、目的とする活性配列が得られません。従って、工程〔2〕の改良だけでなく、工程〔1〕で核酸ライブラリーから不活性配列をできるだけ排除し、活性配列を高純度に分離できるようにすることも大きな課題でした。本法により架橋型核酸をプライマー領域に、塩基修飾核酸を非プライマー領域に含むキメラ型修飾DNAライブラリーから、抗体医薬に匹敵する強さの標的結合性能を持つトロンビン結合性人工核酸アプタマー取得することに成功しました。さらに、架橋型核酸が全長にわたって挿入された修飾DNAライブラリーを用いたトロンビン結合性人工核酸アプタマーの作製にも成功しました。血液を固まりにくくし血栓ができるのを防ぐトロンビン阻害剤は、血栓症や塞栓症などの治療や予防に使われているため、トロンビンは核酸アプタマー開発において最もよく研究されてきた標的のひとつです。これらの研究成果は、架橋型核酸を含む人工核酸アプタマーをSELEX法で作製した世界初の例であり、人工核酸アプタマー開発のマイルストーンとして重要です。血液や体液中にはヌクレアーゼとよばれる種々の核酸分解酵素が存在するため、DNAやRNAなどの核酸は容易に分解されてしまいます。しかし、大阪大学の小比賀・今西らによって開発された2',4'-BNAとよばれる架橋型核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことや細胞毒性が低いことに加え、標的配列を含むDNAやRNAに対して特異的に結合し非常に安定な複合体を形成するため、開発当初より核酸医薬品の有望な候補として脚光を浴びてきました。現在、アンチセンス核酸やアンチジーン核酸、siRNA、miRNAなど、さまざまな核酸医薬品への応用研究が精力的に進められています。今回の成果はそのような応用研究の一つで、核酸アプタマーに関するものです。なお、核酸医薬品の世界市場規模は2025年頃には数兆円規模になるといわれています。従来の抗体と異なり、人工核酸は品質管理が容易で安価に製造できる点もメリットで、本成果を活用し、新規なバイオマーカー検出薬や分子標的薬の創製が期待されます。従来の天然型核酸アプタマーを医薬品とした場合、体内では短時間で分解されて失活するため、十分な効果が得られない一方で、体内における分解耐性を持つ人工核酸である架橋型核酸を用いると、原因物質に結合する核酸を見つけ出す方法がありませんでした。 HGFR(c-Met), Bi-labelled, Magnetic Cell Isolation KitAnti-ERBB2 aptamer, Magnetic Cell Isolation KitVEGFR2, Mono-labelled, Magnetic Cell Isolation KitCD31, Bi-labelled, Magnetic Cell Isolation KitCD31, Mono-labelled, Magnetic Cell Isolation KitTransOMIC Technologies社(メーカー略称：TOT)のRNAiコレクション，cDNAコレクション，Yeastコレクションなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。VEGFR2, Bi-labelled, Magnetic Cell Isolation KitAnti-EGFR aptamer, Biotin, Magnetic Cell Isolation KitOriGene Technologies社(メーカー略称：ORI)のTrueClone / TrueORF / TrueORF Gold cDNAクローンなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。HGFR(c-Met), Mono-labelled, Magnetic Cell Isolation KitHorizon社Dharmacon製品(メーカー略称：DHA)のRNAiコレクション，cDNAコレクション，Yeastコレクションなど，遺伝子機能研究に有用な遺伝子リソースを検索することができます。Anti-EGFR aptamer, Biotin and FITC, Magnetic Cell Isolation KitAnti-ICAM-2 aptamer, Magnetic Cell Isolation Kit(40Rxns)
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